پاورپوینت طراحی پرایمر و کار با نرم افزار Gene Runner (pptx) 27 اسلاید
دسته بندی : پاورپوینت
نوع فایل : PowerPoint (.pptx) ( قابل ویرایش و آماده پرینت )
تعداد اسلاید: 27 اسلاید
قسمتی از متن PowerPoint (.pptx) :
موضوع:
طراحی پرایمر و کار با نرم افزار Gene Runner
طراحی پرایمر صحیح برای درست انجام شدن یک واکنش PCR بسیار ضروری است. برای اکثیر یک قطعه با بهره وری بالا رعایت نکاتی ضروری است:
۱- طول پرایمر:
۲- دمای ذوب پرایمرها:
۳- دمای اتصال پرایمرها:
۴- محتوای GC:
۵- گیره GC(GC clamp):
۶- ساختار ثانویه پرایمر:
۷- تکرارها:
۸- Runs:
۹- پایداری انتهای ‘۳:
۱۰- از ساختارهای ثانویه الگو دوری کنید:
۱۱- از همولوژی متقابل دوری کنید:
۱۲- طول قطعه تکثیر شونده:
۱۳- دمای ذوب جفت پرایمرها:
طول پرایمر:
به طور معمول، طول ۲۲-۱۸ نوکلئوتید برای یک پرایمر بهینه است. اگر طول پرایمر کمتر باشد، احتمال اتصال غیر اختصاصی بالا میرود و اگر از این محدوده بیشتر باشد، اتصال پرایمر به الگو در دمای اتصال سختتر میشود.
۲
- دمای ذوب پرایمرها:
دمای ذوب پرایمرها یا به اصطلاح Tm، دمایی است که نیمی از DNA دو رشتهای از هم جدا میشود و DNA تک رشتهای ایجاد میکند. Tm نشانگر پایداری DNA دورشتهای است. پرایمرهایی با Tm 58-52 درجهی سانتی گراد معمولا بهترین نتایج را به دست میدهند. Tm متاثر از محتوای GC یک توالی است.
۳- دمای اتصال پرایمرها:
دمای ذوب پرایمرها تخمینی از میزان پایداری هیبرید DNA-DNA است و در تعیین دمای اتصال خیلی اهمیت دارد. اگر دمای اتصال(Ta) خیلی بالا باشد، پرایمرها و الگو از هم جدا باقی میمانند و اتصال صورت نمیگیرد و اگر دمای اتصال خیلی پایین باشد تنها برخی از نوکلئوتیدهای پرایمرها به الگو متصل میشود و اتصال درستی رخ نمیدهد و محصولات غیر اختصاصی تولید میشود. از فرمول Rychlik برای به دست آوردن Ta استفاده میشود:
Ta= 0.3×Tm(primer)+ 0.7×Tm(product)−۱۴٫۹
۴- محتوای GC:
نسبت بازهای GC به کل بازها باید بین ۶۰-۴۰ درصد باشد.
۵- گیره GC(GC clamp):
وجود بازهای GC در ۵ باز انتهای ‘۳ پرایمرها(که به آن گیره GC گفته میشود) اتصال اختصاصی در انتهای ‘۳ را بهبود میبخشد(به علت اتصال قویتر بازهای G و C). در ۵ باز انتهایی سمت ‘۳ نباید بیش از G3 یا C قرار داشته باشد.
- ساختار ثانویه پرایمر:
حضور ساختارهای ثانویهای که تحت تاثیر برهم کنشهای بین مولکولی یا درون مولکولی ایجاد میشوند، منجر به تولید محصول بسیار ناچیز PCR میشود و یا اصلا محصولی تولید نمیشود. وجود این ساختارهای ثانویه برخلاف اتصال پرایمرها به الگو و تکثیر عمل میکنند. این ساختارها به میزان قابل توجهی دسترسی به پرایمرها را کاهش میدهند.
– ساختارهای سنجاق سری(hairpins):
این ساختارها جزء برهم کنشهای درون مولکولی پرایمرها هستند و باید از آنها دوری شود. اگر انتهای ‘۳ پرایمر یک ساختار سنجاق سری با ΔG(انرژی آزاد گیبس، هرچه منفیتر باشد، ساختار پایدارتر است) kcal/mol2- داشته باشد و یا یک ساختار سنجاق سری درونی با ΔG= -3 kcal/mol داشته باشد، معمولا قابل تحمل است و مشکلی ایجاد نمیکند.
–
دیمر خودی(self dimer):
دیمر خودی پرایمر ناشی از برهم کنشهای بین مولکولهای پرایمر(از یک جنس) است. معمولا در یک واکنش از مقادیر زیادی از پرایمرها نسبت به میزان الگوی PCR استفاده میشود. وقتی پرایمرها تمایلشان برای اتصال به خودشان بیشتر از تمایلشان برای اتصال به الگو باشد، محصول PCR کمتری تولید میشود. معمولا دیمر انتهای ‘۳ با ΔG= -5 kcal/mol و دیمرهای درونی با ΔG= -6 kcal/mol قابل تحمل هستند.
– دیمر متقابل(cross dimer):
دیمرهایی که براساس برهم کنشهای بین مولکولی بین پرایمرهای سنس و آنتی سنس(جلویی و عقبی) به وجود میآیند. به طور معمول دیمرهای متقابل انتهای ‘۳ با ΔG= -5 kcal/mol و دیمرهای متقابل درونی با ΔG= -6 kcal/mol قابل تحمل هستند.
۷- تکرارها:
شامل تکرارهای دو نوکلئوتیدی که مدام در یک توالی تکرار میشوند. حداکثر تعداد تکرارهای قابل قبول، ۴ تکرار دو نوکلئوتیدی است.
۸- Runs:
منظور پرایمرهایی با تکرارهای تک نوکلئوتیدی زیاد، پشت سر هم است که میتواند باعث اتصال غیر اختصاصی پرایمر شود. به عنوان مثال AGCGGGGGATGGGG تکرارهای ۵ و ۴ تایی از G را دارد. حداکثر تعداد تکرار قابل قبول برای یک باز، ۴ جفت باز است.
۹- پایداری انتهای ‘۳:
منظور حداکثر میزان ΔG برای ۵ باز انتهایی ‘۳ است. انتهای ‘۳ نا پایدار(با ΔG منفی کمتر) منجر به اتصالهای اشتباه کمتری میشود.
